八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)是类胡萝卜素生物合成的关键酶,其编码的PDS基因参与并调控植物类胡萝卜素的累积,PDS基因突变会使植物产生肉眼可见的白化表型,常用来作为检测基因编辑成功与否的标记基因。选取森林草莓FvPDS基因作为靶标,利用CRISPR/Cas9系统构建双靶点基因编辑载体,农杆菌介导法稳定遗传转化森林草莓种质HLJ-005(红果)、HLJ-004(白果),通过TA克隆测序法分析基因编辑的类型。遗传转化HLJ-005约2 250块叶片外植体,筛选到具有卡那霉素抗性的植株147株,通过PCR鉴定,24株为阳性材料,阳性率为16.32%,最后测序获得了5株具有编辑的材料,编辑效率为20.83%;遗传转化HLJ-004约2 305块叶片外植体,获得具有卡那霉素抗性的植株234株,PCR检测为6株阳性材料,阳性率为2.56%,测序只有3株为具有编辑的材料,编辑效率为50%。两个编辑位点都产生了突变,分别是单碱基或多个碱基的缺失,但是这两份种质的突变类型不尽相同。结果表明,利用CRISPR/Cas9系统可以通过稳定表达,HLJ-004、HLJ-005两个森林草莓实现双靶点同时敲除,HLJ-004、HLJ-005可作为草莓基因编辑的遗传转化材料,并验证了适合草莓基因编辑的CRISPR/Cas9系统。
病程相关基因(Pathogenesis-related gene,PR)和β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)基因在植物抵御病害中具有重要作用。以炭疽病抗性存在明显差异的‘鲁康8号’和‘香玲’核桃为试材体外接种胶孢炭疽菌,10 d后‘香玲’青皮病斑明显增大,而‘鲁康8号’无明显变化。转录组分析发现二者青皮的差异基因富集在植物—病原互作、MAPK信号途径和植物激素信号转导等抗病相关途径,并初步筛选到JrPR1和JrPR5、JrGLU和JrGLU5在抗病品种‘鲁康8号’中高表达。组织特异性分析表明JrPR5和JrGLU5分别在芽和叶片中高表达,JrPR1和JrGLU在果实中高表达,可作为调控果实炭疽病抗性候选基因。烟草叶片瞬时表达发现JrPR1定位于细胞壁和细胞间隙,JrGLU定位于细胞壁,并分析了它们编码蛋白的理化性质,二级和三级结构。核桃果实瞬时表达发现JrPR1和JrGLU均能明显抑制胶孢炭疽菌生长,提高果实炭疽病抗性。
以四倍体栽培马铃薯品种‘Desiree’‘青薯9号’和‘晋薯16号’为研究材料,StFBH3、StbHLH52和StPDS为靶基因,构建5个GFP荧光筛选CRISPR/Cas9基因编辑载体。通过发根农杆菌介导的遗传转化法侵染茎段诱导产生毛状根,评估转化频率及编辑效率。进一步探索毛状根再生体系,并对再生马铃薯完整植株进行突变鉴定。测序检测表明5个靶位点在3个品种中均有编辑活性,StPDS单靶点在Desiree和晋薯16号毛状根中的敲除效率分别为87.8%和80.0%,StFBH3单靶点在青薯9号毛状根中的敲除效率为72.7%。StbHLH52的双靶点在Desiree毛状根中的片段删除效率可达19.4%。基因编辑的毛状根经组织培养再生形成植株,Desiree、青薯9号和晋薯16号的再生效率分别为60%、75%和50%,再生植株的编辑效率为100%,且可获得StPDS基因敲除的白化植株。该技术体系的建立可快速验证基因编辑靶位点活性,高效获得基因编辑马铃薯植株,为马铃薯基因功能研究及精准遗传育种提供技术支撑。
为了探究过氧化氢酶基因(CAT)在金针菇(Flammulina filiformis)子实体生长发育过程中的作用,基于全基因组数据鉴定了两个过氧化氢酶基因,分别命名为FfCAT1、FfCAT2。FfCAT1基因开放阅读框长1 557 bp,编码518个氨基酸。FfCAT2基因开放阅读框长1 692 bp,编码563个氨基酸。两个基因编码的蛋白均位于细胞质内,无跨膜结构域,但FfCAT1不具备信号肽,而FfCAT2在第18 ~ 19位氨基酸残基间具有信号肽。保守结构域及系统进化树分析显示,FfCAT1和FfCAT2均属于单功能过氧化氢酶。qRT-PCR的结果显示,FfCAT1在成熟期菌盖中高表达,且在菌盖弹射孢子阶段表达量显著上调,菌褶中的表达量显著高于菌肉组织;FfCAT2在伸长期菌盖中高表达,但在菌盖不同发育阶段的表达量差异较小,仅在直径3.3 cm的菌盖中显著下调;在直径0.9 cm菌盖的菌褶和菌肉组织中无显著差异。研究结果表明,两个FfCAT基因在菌盖生长发育过程发挥不同作用,FfCAT1作为主效基因参与菌盖的发育调控,且与菌褶上孢子的弹射相关。
以7个金耳菌株及转录组测序获得的序列为试材,对金耳转录组序列上的SSR类型及分布进行了研究,设计了100对引物开展试验验证,总计检索到6种SSR类型的4 268个位点,其中主要以三核苷酸重复类型(P3)和六核苷酸重复类型(P6)为主,占总SSR的64.20%。由试验验证获得7对SSR引物,并开展分析。UPGMA聚类结果显示,7个金耳菌株主要分为3个类群。同时,基于7对SSR引物进行金耳的指纹编码构建,获得了7个金耳菌株的14位数字分子指纹数据库编码。以期为金耳的种质资源鉴定、品种选育、分子标记辅助育种等研究提供参考依据。
以月季‘月月红’(Rosa chinensis‘Yueyuehong’)扦插苗为材料,分析了RcTCP9基因在盐和干旱胁迫不同时间的表达模式,结果表明,在盐和干旱胁迫条件下RcTCP9的表达量显著上调,说明其对两种胁迫有积极响应。将RcTCP9在烟草中瞬时表达,通过观察绿色荧光信号发现其编码蛋白定位于细胞核上。病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术和瞬时过表达试验发现,RcTCP9的沉默会导致植株在盐和干旱胁迫下出现叶片及根系萎蔫等生理损伤表征,植物细胞离子渗透率及丙二醛(MDA)含量增加,过氧化氢酶(CAT)及过氧化物酶(POD)活性水平则降低。过表达的月季花瓣应对两种胁迫细胞膜损伤减少,褪色率和MDA含量降低,表现出更好的抗性。测定过表达植株在盐和干旱胁迫下耐逆相关基因的表达水平,结果显示RcTCP9的表达可能通过调控RcPR4-1和RcNAC091相关通路来增强植物的胁迫耐受性。综上所述,RcTCP9在提高月季对盐和干旱胁迫的耐受性方面具有重要作用。
基于《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 蝴蝶兰》,对416份蝴蝶兰品种资源的15个数量性状进行分级,并对其遗传多样性进行研究。结果表明,15个性状均可分为9级表达状态,除花序长、花数量和花序梗长呈现偏左分布,其余性状基本为中间高两端低的分布趋势;各数量性状品种间变异系数较大,遗传多样性指数较高,品种内变异系数较小,说明供试品种稳定性较好且有丰富的遗传多样性;主成分分析可以归纳为植株大小、花数量和花朵大小3个集群,可增加花数量作为DUS测试分组性状;聚类分析在平方欧式距离为5时可将416份品种分为7大类,大部分品种集中在其中4大类。
以84K杨(Populus alba × Populus glandulosa)为试材,克隆得到PagNAC47基因及其启动子。PagNAC47编码区全长1 107 bp,编码368个氨基酸,具有NAC转录因子家族典型的NAM结构域,与毛果杨(P. trichocarpa)PtrNAC47蛋白的同源性最高,为92.2%;PagNAC47启动子序列长度为1 794 bp,含TATA-box和CAAT-box启动子基本元件及生长素(IAA)响应元件等。RT-qPCR分析表明,PagNAC47在老根、次生茎和成熟叶中的表达水平显著高于在幼根、初生茎和幼叶中的表达水平,且在成熟叶中表达水平最高。通过PagNAC47特异启动子驱动GUS报告基因的检测,揭示PagNAC47主要在器官的维管组织和成熟叶中表达。将35S启动子连接PagNAC47转入84K杨发现,与野生型相比,过表达株系的株高、茎粗、次生木质部宽度与层数、导管和纤维细胞面积及形成层层数均显著增加,根中次生木质部也有类似的现象,净光合速率和叶绿素含量显著增加,光合性能增强。PagNAC47的表达受IAA抑制,且抑制作用随IAA浓度的增加逐步增强。
对枳幼苗施加不同浓度(0、10、20、30 μmol · L-1)的外源独脚金内酯类似物GR24,测定生长指标、解剖结构和生理生化等变化,结合实时荧光定量PCR技术分析相关调控基因的表达,全面评估独脚金内酯对枳幼苗茎增粗生长的影响。研究发现枳幼苗茎的增粗生长和GR24浓度相关,只有20 μmol · L-1处理显著促进茎的增粗生长,主要表现为木质部宽度增加,次生细胞壁增厚及木质素、纤维素和半纤维素含量成分的积累,同时茎中内源激素独脚金内酯、生长素和赤霉素含量也显著增加。定量PCR分析表明,20 μmol · L-1GR24显著上调了生长素响应基因(ARF5)、木质部相关基因(KNAT1、STM、CAD)及形成层特异性基因(WOX4)的表达。研究结果表明20 μmol · L-1 GR24是通过促进次生木质部细胞增加和增强木质化过程,以及诱导生长相关激素增加而显著促进枳幼苗茎的增粗。
为鉴定和选育抗蚜豇豆品种,并阐明其抗性机制,采用虫害指数法对实验室保存的5个豇豆品种进行了室内抗蚜性鉴定。结果表明,‘特选张唐王’和‘辽宁营口长豇豆’为抗性品种,‘大白皮’为中抗品种,‘咫尺豇豆’和‘粉红豆角’为高感品种。以抗蚜品种特选张唐王和高感蚜品种咫尺豇豆为参试材料,通过比较豇豆蚜在两个不同品种豇豆上的发育繁殖指标及种群生命表参数发现,抗蚜品种特选张唐王能够显著抑制豇豆蚜的生长发育及种群增长。酶联免疫分析比较了抗、感蚜品种被豇豆蚜取食前后苯丙烷途径相关次生物质和合成酶的影响差异,结果表明,抗蚜豇豆总黄酮和木质素含量以及PAL、C4H的酶活性在接蚜后均显著高于感蚜豇豆品种。本研究中从寄主—害虫互作的角度初步阐明了抗蚜豇豆品种通过激活苯丙烷代谢途径,降低了豇豆蚜种群适合度的抗蚜防御反应机制。
‘冀香’是由‘653-44’ב红颜’杂交选育而成的早熟草莓新品种。果实圆锥形或长圆锥形,果面红色、光泽度好;果肉红色,髓心空洞无或小;一级序果平均单果质量为45.4 g,二级序果平均单果质量为28.8 g;果实风味酸甜可口,香气浓郁,平均可溶性固形物含量12.2%,总糖含量7.79%,总酸含量0.63%,维生素C含量0.616 mg · g-1;果实硬度大(0.568 kg · cm-2),耐贮运性好;抗白粉病、叶斑病;丰产性好,平均单株产量468.4 g;在河北作为冬草莓栽培8月底至9月上中旬定植,11月中旬成熟;作为夏草莓栽培4月中下旬定植,6月中下旬成熟。
‘温选70’系由花椰菜‘瑞雪特大80天’单株优选而来的常规早熟新品种。株形直立到半直立,株高50 cm左右,株幅70 cm左右,叶长48.5 cm,宽27.5 cm,叶色浅绿,叶面蜡粉多。花球半圆,紧实,洁白,横径15.0 cm,纵径8.5 cm,单球质量1.35 kg。适宜浙江地区秋季栽培,从定植到采收70 d左右,产量40.5 t · hm-2。