摘要：

利用在全国大面积推广的8个大白菜良种亲本材料玉青、河头早A、河头早B、青麻叶C、青麻叶D、石特一号9-3、石特一号11-4、运农一号，以其无菌苗子叶为外植体，将抗菌肽基因导入再生系统中，获得了一系列转基因植株。
挑选籽粒饱满的种子，用70%的酒精消毒30~60 s，01%HgCl₂溶液灭菌7～10 min，无菌水清洗4～5遍，播种在1/2MS固体培养基上，在25 ℃和16 h光照/8 h黑暗条件下培养，取3~4 d的无菌苗子叶为外植体。基本培养基为MS，添加不同浓度的BA、NAA和AgNO₃。
所用的根癌农杆菌为LBA4404，含有质粒 pMOG411，携带有抗菌肽基因，该质粒含有抗卡那霉素（kanamycin, Km）筛选的新霉素磷酸转移酶（nptII）基因，基因表达由启动子CaMV35S调控。
将根癌农杆菌单菌落接种于含有30 mg·L^-1 Km和10 mg·L^-1四环素的液体YEB培养基上，28 ℃条件下振荡（200 r·min^-1）过夜培养24 h。第2天取农杆菌培养液于含相同浓度抗生素和200 μmol·L^-1乙酰丁香酮的YEB培养基中继续振荡培养约12 h, 用MS液体培养基稀释后，感染经预培养2 d的无菌苗子叶, 取出外植体用无菌滤纸吸干，转入共培养基上，共培养2 d，最后转到选择培养基上培养。

提取转基因植株和对照植株的基因组DNA，取10 μg用EcoRI 和HindIII在37 ℃条件下消化16 h，作为PCR模板。DNA探针用EcoRI和HindIII消化质粒pMOG411得到，用地高辛标记。
PCR引物为5′GGTACCCTATTAACCCACAG 3′和 5′GAGTGCGCAAGACGTGACG 3′。PCR反应体系为25 μL，反应程序为：94 ℃10 min；然后94 ℃1 min；60 ℃1 min；72 ℃1 min；40个循环，最后72 ℃延伸10 min。取样10 μL在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳检测。
将转基因植株和对照植株的基因组DNA酶切片段用纸吸法转移到尼仑膜上，杂交、洗膜及信号检测。
用植物RNA微量提取试剂盒提取转基因植株和非转基因植株的总RNA，取5 μg总RNA在1.5%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，RNA用EB染色检测后，将分离的RNA转移到尼仑膜上，进行探针标记、预杂交以及杂交。
对5个自交系的转基因植株和对照植株进行PCR扩增，结果显示，转化植株出现了870 bp的PCR扩增带，对照则没有。 Southern杂交显示出阳性结果，进一步证明了抗菌肽基因整合到了大白菜基因组中。通过电泳图谱可知，多数抗菌肽基因在大白菜基因组中以单拷贝形式存在，个别植株呈多拷贝，基因以单拷贝形式存在有利于该基因在后代中得到纯合体，在农业生产中有较大的应用价值。Northern杂交结果证实了抗菌肽基因在大白菜中成功表达。
本研究在培养基成分如激素、抗生素浓度等方面与以前的报道有所不同，使用的材料也不同。与其它的报道相同的是, 大白菜子叶再生时要求筛选培养基中较低浓度的卡那霉素（10 mg·L^-1），这说明大白菜子叶对卡那霉素比较敏感。在农杆菌与外植体创伤面接触时，并不是所有的细胞都处于DNA吸收状态，这是引起植物转基因频率差异的原因之一。此外,苗龄、外植体类型、预培养与否、农杆菌状态以及共培养时间、添加乙酰丁香酮等都会影响外植体的分化过程。

关键词: 大白菜, 抗病, 抗虫, 基因, 转化