以90个苹果栽培品种为试验材料,采集冬季休眠的枝条进行相对电导率测定,评价其耐寒能力;同时利用基因组重测序技术检测到的1 247 162个SNP开展全基因组关联分析,筛选与苹果耐寒性状显著关联的候选基因。鉴定出3个耐寒能力最强的品种,其相对电导率均小于40%,分别是‘金红’(‘Jinhong’),‘埃德尔博斯多夫’(‘Edelborsdorfer’),‘赫拉森’(‘Haralson’)。基于1 247 162个高质量SNP位点与表征耐寒性的相对电导率的指标的关联分析,挖掘出5个与耐寒性显著关联的SNP位点,这些位点分布在4号、15号和16号染色体上,并鉴定到与冷胁迫紧密相关的3个候选基因TIF3B1(MD04G1241100)、COR47(MD15G1003900)和MD16G1069900。
MLO(Mildew Resistance Locus O)家族基因是植物特有的“感病基因”,普遍认为它对白粉病具有负调控作用。目前在单子叶和双子叶植物中发现许多抗白粉病MLO基因,但对于其上游调控因子如何调控其表达而影响白粉病发生的研究却很少。本研究中以易感白粉病的苹果砧木‘青砧1号’叶片为材料,构建其cDNA文库,文库滴度4 × 109 cfu · mL-1,重组率为100%。生物信息分析苹果MdMLO家族基因启动子区共有38种顺式作用元件,包含激素、应激防御和生长发育等响应元件。以TCA和TC-rich repeats为诱饵序列构建诱饵载体,分别命名为Bait-TCA和Bait-TC。利用酵母单杂交的方法筛选其上游调控因子,结果显示Bait-TCA具有自激活现象无法筛选,Bait-TC诱饵载体调取获得30条基因序列,其中6条参与植物抗逆防御反应,推测它们可能通过与TC-rich repeats元件互作来调控MLO的表达,进而调控苹果叶片对于白粉病的响应。
利用拟南芥和苹果愈伤组织等植物材料,研究多肽MhCLE8(CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION 8)调控花青苷积累的作用。结果显示,体外合成MhCLE8p多肽处理拟南芥幼苗和苹果愈伤组织材料显著抑制了花青苷的积累。多序列比对和系统分析结果表明,MhCLE8与多个物种中的同源序列均存在高度保守的CLE基序,其中MhCLE8与杏(CAB4276204.1)和山荆子(TQE01035.1)存在较高的同源关系。在平邑甜茶中克隆MhCLE8,连接双元载体pRI,通过农杆菌介导的转基因技术获得了MhCLE8在拟南芥和苹果愈伤组织中的稳定过表达材料。表型分析表明,MhCLE8转基因拟南芥幼苗和苹果愈伤组织的花青苷积累量显著低于野生型。同时,qRT-PCR结果表明,MhCLE8转基因植物材料中花青苷合成结构基因的表达受到了不同程度的抑制。综上,多肽编码基因MhCLE8是苹果花青苷积累的负调控因子。
以石榴品种‘鲁青1号’‘泰山红’和‘突尼斯软籽’的一年生枝条为试材,采用电解质渗出率拟合 Logistic 方程确定低温半致死温度(LT50)评价抗寒性,测定相对含水量、可溶性蛋白、可溶性糖、丙二醛(MDA)含量,测定过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性,结合田间越冬率、枝条植物学特征、冻害胁迫后枝条恢复能力,研究其越冬期间抗寒性及其生理基础。研究发现:3个品种抗寒能力差异显著,‘鲁青1号’抗寒性最强,田间越冬率远高于‘泰山红’和‘突尼斯软籽’,‘突尼斯软籽’抗寒性最差,田间越冬率为0。与‘突尼斯软籽’相比,‘鲁青1号’枝条粗壮,硬,节间相对短;枝刺粗壮,硬;皮孔封闭早且封闭层数多,包被严密;低温处理后生理指标变化幅度相对小,MDA含量较低,可溶性蛋白含量、POD活性较高,能较好地维持其渗透压和氧化还原平衡,使其抗寒能力远大于‘突尼斯软籽’。
在‘巨峰’葡萄中克隆获得细胞分裂素响应调节因子VlRRA1及其启动子,分析了VlRRA1的表达特征,并对其启动子进行活性分析。结果显示,VlRRA1的cDNA全长为666 bp,编码221个氨基酸;保守结构域预测结果显示该基因仅含有1个磷酸接受结构域(REC),属于A型RR基因;系统进化关系表明VlRRA1与其他物种中的A型RR亲缘关系较近。酵母自激活试验说明VlRRA1不具有转录激活活性,符合A型RR基因的典型特征。qRT-PCR结果表明VlRRA1具有组织表达特异性,主要在茎、叶以及幼果中表达;外源细胞分裂素氯吡苯脲(CPPU)可以促进VlRRA1的表达,而细胞分裂素生物合成抑制剂洛伐他汀(lovastatin,LOV)则抑制VlRRA1的转录。VlRRA1启动子上有多种与非生物胁迫和激素响应相关的元件。GUS组织染色的结果表明,VlRRA1启动子具有活性,可以响应多种激素信号,包括与坐果相关的细胞分裂素、生长素和赤霉素。以上结果表明VlRRA1在细胞分裂素介导的葡萄坐果与幼果发育中具有重要作用。
不同园艺植物花芽分化时期的划分略有差异,分化时间有所不同。影响花芽分化的内在因素包括内源激素和营养物质。内源激素主要有生长素、赤霉素、脱落酸和细胞分裂素。光照、温度、水分、矿物质营养可通过调控激素水平影响园艺植物的成花。花芽分化机理有碳氮比学说、激素平衡假说、激素信号调节假说和营养假说。同时,随着对各园艺植物花芽分化研究的深入,研究者们发现花芽分化过程与相关基因的表达有关。综述了近年来园艺植物花芽分化的相关研究进展,并对未来主要的研究方向进行展望。
以‘北醇'葡萄两性花、‘1613C'葡萄雄花和‘520A'葡萄雌花为材料,测定始蕾期、大蕾期和盛花期花器官的激素含量并进行转录组测序。各激素在不同性别花中的积累量不同,同一性别花器官不同发育时期激素含量也有差异,在大蕾期雌花中IAA、ABA、MeJA含量最高。转录和代谢联合分析共获得31 965个表达基因,其中与花发育直接相关的基因1 535个,部分基因持续上调或下调,持续上调的基因主要参与苯丙烷合成、植物激素信号转导等通路,持续下调基因主要参与淀粉和糖代谢、氨基酸合成等通路。AP1、SEP1、AG2、SOC1等MADS-box基因在不同花器官和不同发育时期差异表达。MADS-box基因、开花诱导整合子基因及解毒和应激相关基因的差异表达对花性别分化具有重要作用。
为了构建番茄CRISPR/Cas9介导的多基因编辑体系,用SlU6-2p、SlU6-3p、SlU6-7p、SlU3-5p、SlU3-9p和SlU6-5p启动子分别替换pKSE401和pCBC-DT1T2载体中的拟南芥U6启动子,构建了1个双元载体(pMGET)、2个中间载体(pKC-S2M和pKC-S3M)和3个gRNA模块载体(pCBC-S1、pCBC-S2和pCBC-S3)。为了测试该多基因编辑体系,通过PCR扩增、Golden gate克隆和同尾酶技术,将含有6个番茄果实性状相关基因Green flesh(GF)、Ovate(O)、Locule number(LC)、SlMYB12(Y)、Tangerine(T)、Uniform ripening(U)靶点序列的sgRNA聚合构建多基因编辑载体pMGET-OYGTULC和pMGET-TULCOYG,检测6个基因同时被编辑的效率分别为44.00%和11.76%。用携带pMGET-OYGTULC载体的根癌农杆菌转化番茄材料获得2株6个基因均被编辑的植株,序列变异为单个碱基的插入、单个或多个碱基的缺失及大片段的缺失等多种形式。本研究中该多基因编辑体系可以高效地应用于番茄多基因编辑,并且可以得到稳定遗传的突变体,可为番茄基础研究和遗传改良提供一个简便的工具箱。
以国家园艺种质资源库郑州梨分库296份种质资源为试材,在果实成熟期测定果实表面果点大小、密度、凹凸、单位果面果点面积之和,对不同种质资源果实外观品质进行感官综合评价,利用灰色关联分析(Grey relation analysis,GRA)和聚类分析(Cluster analysis,CA)建立不同种质资源果点性状综合评价模型。利用灰色关联分析法得出296份梨种质资源果点性状的相对关联度变化范围在0.3158 ~ 0.6526之间,将296份资源划分为优、良、中、差、极差5个等级。筛选出‘Autumn Red’‘Red Sensatian’‘中梨美萃’‘巴梨’‘大巴梨’等果点性状优良、外观品质优异的种质,及‘蒲瓜梨’‘细花麻壳’‘茌梨’‘恩梨’等果点性状差、外观品质不佳的种质。这一结果与感官评价结果一致。系统聚类分析法将296份梨种质资源聚为5类,对应果点性状优、良、中、差、极差5个等级,分别占种质资源的7.8%、8.8%、37.2%、34.1%、12.1%。综合以上分析方法筛选出的果点性状优异的种质资源可作为梨外观品质改良的基础材料,果点性状极差的种质资源可作为研究梨果点性状的形成和调控机制的材料。
为探究中国南方暖湿地区甜樱桃适栽品种花芽休眠阶段的分子调控机制,以杭州地区种植的2个不同需冷量甜樱桃品种‘布鲁克斯’和‘萨米脱’为材料,分别于休眠前期(S1)、内休眠期(S2)和萌芽前期(S3)采集花芽,通过转录组测序比较2个品种间的基因表达差异。分析表明,S1、S2和S3时期分别获得343、671和1 588个差异表达基因,其中S3的差异基因数最多。GO分析表明,细胞组建、细胞代谢过程、刺激响应以及转运蛋白活性相关的基因在3个时期品种间均表现出显著差异。KEGG分析表明,S3富集的差异基因数及相关代谢途径最多,主要集中在糖代谢和蛋白质合成加工相关途径以及植物—病原互作、植物激素信号转导等途径,表达趋势分析显示部分差异基因可能参与调控甜樱桃花芽休眠状态的转换。通过转录因子预测分析,筛选到包含9个转录因子家族的42个差异表达转录因子,其中AP2/ERF、MYB、WRKY、C2H2、C3H和MADS-box家族的13个转录因子在S2的表达量显著高于S1和S3,表明这些转录因子可能参与了甜樱桃花芽休眠期的调控。
以中国野生山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)‘通化3号’和刺葡萄(V. davidii Foex.)‘塘尾’为材料,克隆得到芪合成酶基因VaSTS19和VdSTS19。序列分析发现VaSTS19和VdSTS19的编码区均为1 179 bp,编码392个氨基酸,定位于16号染色体,二者核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.81%和98.21%。亚细胞定位结果显示VaSTS19和VdSTS19均定位于细胞膜、细胞质和细胞核。将35S强启动子连接VaSTS19和VdSTS19转入番茄能显著促进STS19的表达及番茄中白藜芦醇的合成和积累。分别从两种材料中克隆得到VaSTS19和VdSTS19的启动子。顺式作用元件分析表明,二者启动子中均包含多个胁迫应答元件、激素应答元件及光应答元件。序列分析发现二者启动子序列与欧洲葡萄VST2启动子序列同源性为60%。转基因烟草叶片中二者不同长度启动子片段对SA和MeJA诱导响应明显。结果表明STS19的表达模式和白藜芦醇的合成可能与其上游启动子类型和调控有关。
为探究黄肉桃果实中MADS-box家族转录因子对类胡萝卜素代谢的调控作用,从黄肉桃果实中克隆得到两个MADS基因,分别命名为PpMADS2(PRUPE_5G208500)和PpMADS3(PRUPE_5G208400)。PpMADS2开放阅读框为768 bp,编码255个氨基酸;PpMADS3开放阅读框为756 bp,编码251个氨基酸。生物信息分析显示二者蛋白的N端均含有MADS-box家族典型的特征结构域。亚细胞定位分析显示PpMADS2和PpMADS3定位于细胞核。荧光定量PCR结果表明PpMADS2、PpMADS3以及类胡萝卜素合成基因PpPSY和PpCHYB在黄肉桃果实成熟过程中表达量呈上升趋势,与果实成熟期间类胡萝卜素的含量增加一致。酵母双杂交试验结果表明PpMADS2和PpMADS3蛋白存在相互作用。双荧光素酶试验结果表明PpMADS2和PpMADS3可以协同激活PpPSY和PpCHYB启动子。因此推测PpMADS2和PpMADS3可通过转录激活PpPSY和PpCHYB促进桃果实类胡萝卜素的积累。
利用生物信息鉴定百子莲MYB家族成员,挖掘并验证了调控百子莲蓝色花色形成的关键基因。以全长转录组测序数据作为参考序列,鉴定得到百子莲123个MYB家族成员,包括60个R2R3-MYB、4个3R-MYB、2个4R-MYB和57个1R-MYB基因。对调控类黄酮生物合成的主要亚家族R2R3-MYB进行分析发现,R2-和R3-repeats的序列较为保守,根据系统进化关系分为22个亚组(A1 ~ A22)。特殊的是,相较拟南芥的25个亚组,百子莲缺乏正向调控花色素苷合成的典型亚组S6。与花色形成相关的其他亚组有A18、A17和A16,其成员ApMYB4、ApMYB6、ApMYB7、ApMYB12和ApMYB111定位于细胞核,ApMYB123集中分布于核仁中。在蓝色百子莲花瓣着色过程中,ApMYB12显著上调表达,而ApMYB111显著下调表达。ApMYB4、ApMYB6和ApMYB7在蓝花各发育阶段的表达量均低于白花,预示这些基因可能是百子莲蓝色形成的负调控因子。ApMYB123在白花的开放前期大量表达,说明该基因可能在此阶段促进花瓣合成原花青素。在烟草中过表达ApMYB12,烟草花瓣颜色较野生型变浅,花色素苷含量减少54.55% ~ 62.50%,而黄酮醇含量提高125% ~ 170%,证实ApMYB12调控辅助色素黄酮醇的生物合成,从而影响蓝色的形成。
泛素结合酶E2是底物泛素化的关键酶,通过泛素—蛋白酶体系统对雌蕊S-RNase进行泛素化和降解,在自交不亲和机制中发挥重要作用。以‘无籽沙糖橘’和‘沙糖橘’的花蕾为试材,以甜橙EST序列EY715921为依据克隆到965 bp的cDNA全长序列,其编码152个氨基酸的UBC2蛋白,命名为CrUBC2。在‘无籽沙糖橘’和‘沙糖橘’的编码区发现1个C/T替换,并引起苏氨酸(Thr)变成异亮氨酸(Ile)。多序列比对表明‘沙糖橘’与其他8种植物UBC2仅有1个氨基酸差异,表现出进化中的高度保守性。qRT-PCR分析表明CrUBC2在花药中的表达量最高,异交授粉后的基因表达量是自交授粉的2.22倍 ~ 5.36倍,呈现明显的特异表达。体外花粉萌发试验表明,‘无籽沙糖橘’CrUBC2蛋白对自交花粉管生长有明显抑制作用,但对异交花粉管生长无影响,这可能与该蛋白参与S-RNase泛素化并导致异交亲和有关。
为明确引起温室栽培的新几内亚凤仙花(Impatiens hawkeri)根腐病病原菌种类,采集具有典型根腐病症状的材料通过组织分离法对病原菌进行分离和纯化,结合病原菌形态学特征及ITS、COXⅡ序列分析,确定病原菌为旋柄疫腐霉(Phytopythium helicoides)。柯赫氏法则验证表明,旋柄疫腐霉对新几内亚凤仙花具有强烈的致病性。寄主范围测定表明,该菌还可侵染凤仙花(I. balsamina)、四季海棠(Begonia cucullata)、丽格海棠(B. elatior)、天竺葵(Pelargonium hortorum)、微型月季(Rosa hybrida)、玫瑰(R. rugosa)、倒挂金钟(Fuchsia hybrida)、玉树(Crassula arborescens)和长寿花(Kalanchoe blossfeldiana)等9种园艺植物。培养特性表明,该菌菌丝最佳生长温度为27 ~ 32 ℃,最佳培养pH为6 ~ 7。采用含药平板法测定了10种商品杀菌剂对病原菌的毒力,结果表明10%氟噻唑吡乙酮可分散油悬浮剂、98%噁霉灵可溶性粉剂、40%烯酰吗啉水分散颗粒剂和80%代森锰锌可湿性粉剂毒力最强。
芥菜(Brassica juncea)对多种重金属具有富集能力。重金属ATP酶(heavy metal transporting ATPase,HMA)在植物转运重金属过程中具有重要的作用。基于基因组和转录组数据,对芥菜HMA家族基因成员进行了全基因组鉴定。芥菜基因组中包含27个HMA基因,其编码的蛋白质中有6个不稳定指数大于40,有22个为疏水性蛋白;这些基因聚类为P-1B-1、P-1B-2和P-1B-4等3个亚家族;27个HMA蛋白均为膜蛋白,都具有E1-E2 ATPase和hydrolase结构域;芥菜HMA蛋白都含有8 ~ 15个保守基序,不同亚族因具有独特的保守基序结构从而转运重金属的种类不同;在芥菜HMA基因启动子区域中与生长发育有关的顺式作用元件TGA和与逆境响应相关的顺式作用元件ABRE、MBS、LTR、TC广泛分布;在镉胁迫下,BjuA033764、BjuB019118、BjuB035256、BjuB045293等基因在叶片中表达量明显上调,BjuA003596、BjuB040613、BjuA025022等基因在根系中表达量明显上调,说明其参与了芥菜对镉胁迫的响应。