园艺学报 ›› 2025, Vol. 52 ›› Issue (4): 821-834.doi: 10.16420/j.issn.0513-353x.2024-0594
收稿日期:
2024-10-11
修回日期:
2025-03-10
出版日期:
2025-05-08
发布日期:
2025-04-25
通讯作者:
基金资助:
LIANG Jing, ZENG Baozhen, LIANG Guoping, MAO Juan, CHEN Baihong*()
Received:
2024-10-11
Revised:
2025-03-10
Published:
2025-05-08
Online:
2025-04-25
摘要:
为探究葡萄VvARF18在果实发育中的分子机制,以‘红地球’葡萄(Vitis vinifera‘Red Globe’)为材料,克隆了VvARF18基因,对其进行生物信息分析;将该基因在番茄中异源过表达以验证其对果实发育的影响。VvARF18基因CDS长度为2 109 bp2 109 bp,编码703个氨基酸,pI为6.50。系统进化分析表明,VvARF18与河岸葡萄(Vitis riparis)VrARF18蛋白的亲缘关系最近;在番茄中异源过表达,T3代转基因番茄果实纵横径显著高于野生型,其体积与单果质量明显增加,表明VvARF18对果实膨大具有正调控的作用;转录激活试验发现VvARF18没有毒性但具有自激活活性,筛选与其保守功能结构域B3-Auxin存在互作的蛋白,发现其与信号复合体VvCOP9存在潜在互作关系。
梁靖, 曾宝珍, 梁国平, 毛娟, 陈佰鸿. 葡萄VvARF18调控果实膨大及其互作蛋白筛选[J]. 园艺学报, 2025, 52(4): 821-834.
LIANG Jing, ZENG Baozhen, LIANG Guoping, MAO Juan, CHEN Baihong. Grapevine VvARF18 Regulates Fruit Expansion and Screening of its Interacting Proteins[J]. Acta Horticulturae Sinica, 2025, 52(4): 821-834.
用途 Application | 引物名称 Primer name | 引物序列(5′-3′)Primer sequence |
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构建过表达载体Construction of overexpression vectors | VvARF18 | F:TTTGGAGAGGACACGCTCGAGATGGCGCATGGGAATAATATCA |
R:GCCCTTGCTCACCATGAATTCCTATGGTTCAGTTCTTAACTCTGAATCC | ||
构建BD载体 Building the BD Carrier | VvARF18-BD | F:AGGCCGAATTCCCGGGGATCCTTATGGCGCATGGGAATAATATCA |
R:CCGCTGCAGGTCGACGGATCCCTATGGTTCAGTTCTTAACTCTGAATCC | ||
VvARF18-1 | F:AGGCCGAATTCCCGGGGATCCTTATGGCGCATGGGAATAATATCA | |
R:CCGCTGCAGGTCGACGGATCCCTAAAATGAATGAACGGTTTGTTTTG | ||
VvARF18-2 | F:AGGCCGAATTCCCGGGGATCCTTATGTGCAAGATTTTAACGGCCT | |
R:CCGCTGCAGGTCGACGGATCCCTACTTCAATGAACGCCATTTAGAA | ||
VvARF18-3 | F:AGGCCGAATTCCCGGGGATCCTTATGATTCAATGGGATGAACCTGC | |
R:CCGCTGCAGGTCGACGGATCCCTATGGTTCAGTTCTTAACTCTGAATCC | ||
VvCOP9 | F:GTGGGCATCGATACGGGATCCTTATGGAACCCTACTCCTTCACATCC | |
R:CAGCTCGAGCTCGATGGATCCTCAAGTTTCAATCATGGGTTCTGG | ||
内参基因 Reference gene | Actin | F:GCCGACTACAACATCCAGAAGG |
R:TGCAACACAGCGAGCTTAACC |
表1 本研究中的引物序列
Table 1 Primers used in this study
用途 Application | 引物名称 Primer name | 引物序列(5′-3′)Primer sequence |
---|---|---|
构建过表达载体Construction of overexpression vectors | VvARF18 | F:TTTGGAGAGGACACGCTCGAGATGGCGCATGGGAATAATATCA |
R:GCCCTTGCTCACCATGAATTCCTATGGTTCAGTTCTTAACTCTGAATCC | ||
构建BD载体 Building the BD Carrier | VvARF18-BD | F:AGGCCGAATTCCCGGGGATCCTTATGGCGCATGGGAATAATATCA |
R:CCGCTGCAGGTCGACGGATCCCTATGGTTCAGTTCTTAACTCTGAATCC | ||
VvARF18-1 | F:AGGCCGAATTCCCGGGGATCCTTATGGCGCATGGGAATAATATCA | |
R:CCGCTGCAGGTCGACGGATCCCTAAAATGAATGAACGGTTTGTTTTG | ||
VvARF18-2 | F:AGGCCGAATTCCCGGGGATCCTTATGTGCAAGATTTTAACGGCCT | |
R:CCGCTGCAGGTCGACGGATCCCTACTTCAATGAACGCCATTTAGAA | ||
VvARF18-3 | F:AGGCCGAATTCCCGGGGATCCTTATGATTCAATGGGATGAACCTGC | |
R:CCGCTGCAGGTCGACGGATCCCTATGGTTCAGTTCTTAACTCTGAATCC | ||
VvCOP9 | F:GTGGGCATCGATACGGGATCCTTATGGAACCCTACTCCTTCACATCC | |
R:CAGCTCGAGCTCGATGGATCCTCAAGTTTCAATCATGGGTTCTGG | ||
内参基因 Reference gene | Actin | F:GCCGACTACAACATCCAGAAGG |
R:TGCAACACAGCGAGCTTAACC |
图1 VvARF18的生物信息分析 A:基因结构分析;B:蛋白二级结构预测;C:蛋白三级结构预测;D:蛋白分子跨膜结构域预测;E:蛋白亲水性预测;F:近缘同源系统发育树
Fig. 1 Bioinformatics analysis of VvARF18 A:Gene structure analysis;B:Protein secondary structure prediction;C:Protein tertiary structure prediction;D:Protein molecule transmembrane structural domain prediction;E:Protein hydrophilicity prediction;F:Phylogenetic tree of close homologs
图3 VvARF18基因PCR电泳图谱 A:VvARF18基因克隆(M:Trans2K DNA marker;11 ~ 3表示克隆所得目的条带);B:VvARF18基因表达载体大肠杆菌菌液PCR结果(M:Trans5K DNA marker;1 ~1 ~ 5表示VvARF18基因表达载体大肠杆菌菌液PCR条带);C:VvARF18基因农杆菌菌液PCR结果(M:Trans2K DNA marker;1 ~1 ~ 5表示VvARF18基因表达载体农杆菌菌液PCR条带)
Fig. 3 PCR electrophoresis map of VvARF18 gene A:VvARF18 gene cloning(M:Trans2K DNA marker;1-3 indicates the target bands obtained from cloning);B:VvARF18 gene expression vector Escherichia. coli bacterial liquid PCR results(M:Trans5K DNA marker;1-5 indicates VvARF18 gene expression vector Escherichia. coli bacterial liquid PCR band);C:VvARF18 gene Agrobacterium bacterial liquid PCR results(M:Trans2K DNA marker;1-5 indicates VvARF18 gene expression vector Agrobacterium liquid PCR bands)
图5 VvARF18过表达番茄植株的验证(A、B)及果实形态(CC ~ F)和果实细胞观察(G、H) A:PCR鉴定VvARF18转基因株系;B:野生型(WT)和VvARF18过表达植株(OE-3、OE-5、OE-9)中VvARF18的表达量。C:野生型(WT)和过表达VvARF18转基因植株的表型;DD ~ E:过表达VvARF18转基因番茄单果质量、果实纵径和横径;G、H:野生型(WT)和过表达VvARF18的细胞图。M:Trans 5 000 bp5 000 bp DNA marker;P:阳性对照;N:阴性对照;11 ~ 10:鉴定转基因番茄10个株系的PCR条带。* * 表示与野生型相比在0.05水平上差异显著;不同小写字母表示材料间差异显著(P P < 0.05)
Fig. 5 Validation of VvARF18 overexpressing tomato plants(A,B)and fruit morphology(C-F)and fruit cell observation(G,H) A:PCR identification of VvARF18 transgenic lines;B:Expression of VvARF18 in wild-type(WT)and VvARF18 overexpressing plants(OE-3,OE-5,OE-9);C:Phenotypes of wild-type(WT)and overexpressing VvARF18 transgenic plants;D-F:Single fruit mass,longitudinal diameter and transverse diameter of overexpressed VvARF18 transgenic tomato;G,H:Cytological map of wild-type(WT)and overexpressing VvARF18;M:Trans5 000 bp000 bp DNA;P:Positive control;N:Negative control;1-10:PCR bands of 10 strains of transgenic tomato identified. * indicates significant difference at 0.05 level compared with wild-type
图6 VvARF18转录激活分析 A:自激活活性检测;B:蛋白结构域分段;C:自激活活性分段检测。10-1、10-2、10-3代表稀释倍数。BD为pGBKT7
Fig. 6 Analysis of VvARF18 transcriptional activation A:Self-activating activity assay;B:Protein structural domain segmentation;C:Segmented assay of self-activating activity. 10-1,10-2,and 10-3 represent dilutions. pGBKT7 for BD
图7 VvARF18-2-pGBKT7文库筛选(A)及PCR扩增鉴定(B)和COP9互作验证(C) M:Trans2K DNA Marker;1 1 ~ 17代表筛库后部分基因的PCR条带。DDO:SD/-Trp-Leu,QDO:SD/-Ade-His-Leu-Trp,X:X-α-gal。10-1, 10-2,10-3代表稀释倍数
Fig. 7 Screening of VvARF18-2-pGBKT7 library(A)and identification of PCR amplification(B)and validation of COP9 interactions(C) M:Trans2K DNA Marker;1-17 represent PCR bands for selected genes after screening library. DDO:SD/-Trp-Leu,QDO:SD/-Ade-His-Leu-Trp,and X:X-α-gal. 10-1,10-2,10-3 represent dilutions
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