植物CRISPR/Cas无外源DNA基因组编辑技术研究进展

doi:10.16420/j.issn.0513-353x.2023-0894

园艺学报 ›› 2024, Vol. 51 ›› Issue (8): 1927-1948.doi: 10.16420/j.issn.0513-353x.2023-0894

植物CRISPR/Cas无外源DNA基因组编辑技术研究进展

陆地¹^,², 胡春华¹, 盛鸥¹, 杨乔松¹, 窦同心¹, 何维弟¹, 邓贵明¹, 高慧君¹, 刘思文¹, 李春雨¹, 董涛¹, 易干军¹^,^*(), 毕方铖¹^,^*()

¹ 广东省农业科学院果树研究所/农业农村部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室/广东省热带亚热带果树研究重点实验室，广州 510640
² 华中农业大学园艺林学院，武汉 430070

收稿日期:2024-01-26 修回日期:2024-05-29 出版日期:2024-08-25 发布日期:2024-08-22
通讯作者:
^*E-mail：bifangcheng@gdaas.cn，
yiganjun@vip.163.com
基金资助:
国家重点研发计划项目(2019YFD1000900); 国家自然科学基金项目(32172544); 广州市科学研究重点项目(201904020033); 现代农业产业技术体系建设专项(CARS-31-01); 广东省农科院中青年人才培养项目(R2023PY-JG003); 广东省农业村厅香蕉种业创新园项目(2022-NJS-00-001)

Advances in the CRISPR/Cas DNA-Free Genome Editing in Plant

LU Di¹^,², HU Chunhua¹, SHENG Ou¹, YANG Qiaosong¹, DOU Tongxin¹, HE Weidi¹, DENG Guiming¹, GAO Huijun¹, LIU Siwen¹, LI Chunyu¹, DONG Tao¹, YI Ganjun¹^,^*(), BI Fangcheng¹^,^*()

¹ Institute of Fruit Tree Research，Guangdong Academy of Agricultural Science/Key Laboratory of South Subtropical Fruit Tree Biology and Genetic Resources Utilization，Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangdong Provincial Key Laboratory of Tropical and Subtropical Fruit Research，Guangzhou 510640，China
² College of Horticulture and Forestry，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China

Received:2024-01-26 Revised:2024-05-29 Published:2024-08-25 Online:2024-08-22

摘要/Abstract

摘要：

CRISPR/Cas基因组编辑技术已成为作物遗传改良的重要工具。常见的农杆菌介导或基因枪投送DNA基因组编辑方式会导致外源载体片段整合到植物基因组中，引发消费者对其潜在生物安全的担忧。目前已有部分植物建立了无外源DNA基因组编辑体系，但存在投送效率低、编辑效率低和再生困难等问题。本文中主要对植物CRISPR/Cas无外源DNA基因组编辑体系建立和应用研究中编辑元件载体、介导投送方式及常用的编辑策略等3个方面的进展进行了归纳，总结了存在的主要问题并对未来努力方向进行了展望。

关键词: CRISPR/Cas, 基因组编辑, 无外源DNA, 编辑元件载体, 介导投送方式, 生物安全

Abstract:

CRISPR/Cas genome editing technology has become an important tool for the genetic improvement of crops. However，common genome editing methods of Agrobacterium-mediated or particle bombardment delivery DNA can lead to the integration of exogenous vector fragments into the plant genome，raising consumer concerns about its potential biosafety. At present，some plants have established DNA-free genome editing systems，but there are problems such as low delivery efficiency，low editing efficiency，and regeneration difficulties. In this review，the advances in the establishment and application of plant CRISPR/Cas DNA-free genome editing system were summaried from three aspects：the vector elements，delivery methods and the commonly used editing strategy. The main existing problems and future perspectives were discussed.

Key words: CRISPR/Cas, genome editing, DNA-free editing strategy, vector elements, delivery methods, biosafety

陆地, 胡春华, 盛鸥, 杨乔松, 窦同心, 何维弟, 邓贵明, 高慧君, 刘思文, 李春雨, 董涛, 易干军, 毕方铖. 植物CRISPR/Cas无外源DNA基因组编辑技术研究进展[J]. 园艺学报, 2024, 51(8): 1927-1948.

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图/表 4

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物种 Species	投送方式 Delivery methods	投送形式 Delivery form	植物受体 Receptor	基因（编辑效率/%） Gene（Editing efficiency）	系统 System		策略 Strategy	再生 Regene-ration		参考文献 Reference
拟南芥 Arabidopsis thaliana	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	AOC（16）， BRI1（54 ~ 71）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	否 No		Woo et al.,2015
拟南芥 Arabidopsis thaliana	农杆菌 Agrobacterium	DNA	未成熟胚 Immature embryo	GL（1.6）	CRISPR/Cas9		先编辑后清除 Post-editing elimination	是 Yes		Kelliher et al.,2019
烟草 Nicotiana tabacum	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	AOC（44）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	否 No		Woo et al.,2015
	农杆菌Agrobacterium	DNA	外植体 Explant	PDS（8.2）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Chen et al.,2018
	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	ACO（0.08 ~ 0.90）	CRISPR/Cas12a		瞬时表达 Transient expression	否 No		Kim et al.,2017
	病毒 Virus	RNA	细胞悬浮液 ECS	PDS（57）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Ma et al.,2020
	脂质体 Liposomes	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	pporRFP（6）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	否 No		Liu et al.,2020
	基因枪 Gene gun	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	pporRFP（3）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	否 No		Liu et al.,2020
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	叶片 Leaf	ALS/PDS（< 35）	CRISPR/Cas12a & CBE		共编辑 Co-editing	是 Yes		Huang et al.,2023
	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	PDS（15.4 ~ 68.6）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Liu et al.,2023b
本氏烟草 Nicotiana benthamiana	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	PDS，RDR6， SGS3（40 ~ 91）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	否 No		Ma et al.,2020
	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	PDS（57）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Ma et al.,2020
	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	TOM1（62）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Ariga et al.,2020
	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	TOM1（61）	CBE		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Ariga et al.,2020
	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	PDS（68.1），FucT（46.4），DCL2（31.3）	CRISPR/Cas12a		瞬时表达 Transient expression	否 No		Liu et al.,2023b
	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	PDS（21.1 ~ 95.0），RDR6 （61.5 ~ 81.8），SGS3（26.4），FucT（27.7 ~ 55.0），BBL（38.6）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Liu et al.,2023b
	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	PDS（57）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Ma et al.,2020
番茄 Solanum lycopersicum	农杆菌 Agrobacterium	DNA	子叶片 Cytoledon	ALS（4.90）	CBE		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Danilo et al.,2019
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	叶片 Leaf	ALS（12.9）	CBE		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Veillet et al.,2019
番茄 Solanum lycopersicum	农杆菌 Agrobacterium	DNA	愈伤组织 Callus	ALS/ER（18.80）	CRISPR/Cas12a & CBE		共编辑 Co-editing	是 Yes	Huang et al.,2023
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	愈伤组织 Callus	ALS/RBL2
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	愈伤组织 Callus	ALS/ RbohD（12）
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	愈伤组织 Callus	ALS/SlEDS1/SlPAD4（36.30）
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	愈伤组织 Callus	ALS/DMR6/SlINVINH1（42.10）
	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	PDS（62.9）	CRISPR/Cas12a		瞬时表达 Transient expression	否 No	Liu et al.,2023b
	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	PDS（21.2 ~ 78.2）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes	Liu et al.,2023b
小麦 Triticum aestivum	基因枪 Gene gun	DNA	胚 Embryo	GASR7、GW2、 LOX2（4.8 ~ 36.8）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes	Zhang et al.,2016
	基因枪 Gene gun	RNA	胚 Embryo	GW2 （35.30）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes	Zhang et al.,2016
	基因枪 Gene gun	RNA	未成熟胚 Immature embryo	GASR7、GW2、LOX2	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes	Liang et al.,2018
	基因枪 Gene gun	核糖核酸蛋白复合物RNP	未成熟胚 Immature embryo	GASR7、GW2、 LOX2（1.8 ~ 33.6）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes	Liang et al.,2018
	基因枪 Gene gun	核糖核酸蛋白复合物RNP	未成熟胚 Immature embryo	GW2（21.8 ~ 33.4）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes	Liang et al.,2017
	基因枪 Gene gun	核糖核酸蛋白复合物RNP	未成熟胚 Immature embryo	GASR7（45.3）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes	Liang et al.,2017
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	未成熟胚 Immature embryo	GT（0.68）	CRISPR/Cas9		先编辑后清除 Post-editing elimination	是 Yes	Kelliher et al.,2019
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	未成熟胚 Immature embryo	BRI1（3.6 ~ 33）BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE1）、SD1（9 ~ 50）	CRISPR/Cas9		先编辑后清除 Post-editing elimination	是 Yes	Budhagatapalli et al.,2020
玉米 Zea mays	基因枪 Gene gun	核糖核酸蛋白复合物RNP	胚 Embryo	LIG1（9.7）ALS、 MS26（2.4）、MS45（4.0）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes	Svitashev et al.,2016
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	未成熟胚 Immature embryo	VLHP（8.8）、GW（4.7）	CRISPR/Cas9		先编辑后清除 Post-editing elimination	是 Yes	Kelliher et al.,2019
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	未成熟胚 Immature embryo	LG1（4.1）	CRISPR/Cas9		先编辑后清除 Post-editing elimination	是 Yes	Wang et al.,2019
	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	IPK（0.85 ~ 5.85）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	否 No	Sant’Ana et al.,2020
水稻 Oryza sativa	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	P450（19）、DWD1（8.4）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	否 No	Woo et al.,2015
水稻 Oryza sativa	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	合子 Zygote	DsRed2（25）、 DL（13.6）、GW7（21.4）、 GCS1（64）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes	Toda et al.,2019
莴苣 Lactuca sativa var. ramosa	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	BIN2 (46)	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Woo et al.,2015
马铃薯 Solanum tuberosum	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	GBSS（1 ~ 25）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Andersson et al.,2018
	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	PPO2（27 ~ 68）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		González et al.,2019
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	块茎、叶片 Tuber，leaf	PDS（47 ~ 88）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Bánfalvi et al.,2020
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	茎、叶柄 Stem，petiole	ALS（10）	CBE		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Veillet et al.,2019
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	叶片 Leaf	ALS/ DMR6（33.3）	CRISPR/Cas12a & CBE		共编辑 Co-editing	是 Yes		Huang et al.,2023
大豆 Glycine max	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	FAD2（0 ~ 11.7）	CRISPR/Cas12a		瞬时编辑 Transient expression	否 No		Kim et al.,2017
大豆 Glycine max	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	子叶、原生质体 Cotyledonprotoplast	FAD2（1.9 ~ 17.5）	CRISPR/Cas12a		瞬时编辑 Transient expression	否 No		Kim & Choi,2020
苹果 Malus pumila	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	DIPM1（6.7）、DIPM2（0.5 ~ 3.3）、DIPM4（2.5 ~ 6.9）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	否 No		Malnoy et al.,2016
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	外植体 Explant	DIPM4（1.55 ~ 2.55）	CRISPR/Cas9		先编辑后清除 Post-editing elimination	是 Yes		Pompili et al.,2020
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	外植体 Explant	DIPM1、DIPM4（0 ~ 100）	CRISPR/Cas9		先编辑后清除 Post-editing elimination	是 Yes		Dalla Costa et al.,2020
葡萄 Vitis vinifera	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	MLO-7（0.10）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Post-editing elimination	否 No		Malnoy et al.,2016
葡萄 Vitis vinifera	农杆菌 Agrobacterium	DNA	愈伤组织 Callus	MLO7和IdnDH（0 ~ 50）	CRISPR/Cas9		先编辑后清除 Post-editing elimination	是 Yes		Dalla Costa et al.,2020
柑橘 Citrus reticulate	农杆菌 Agrobacterium	DNA	上胚轴 Epicotyl	ALS/Lob1启动子（1.90）	CRISPR/Cas12a & CBE		共编辑 Co-editing	是 Yes		Huang et al.,2023
柑橘 Citrus reticulate	农杆菌 Agrobacterium	DNA	上胚轴 Epicotyl	ALS	CBE		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Huang et al.,2022
香蕉 Musa paradisiaca	农杆菌 Agrobacterium	DNA	胚性细胞悬浮系 ECS	PDS（89.29）	CRISPR/Cas9		先编辑后清除 Post-editing elimination	是 Yes		Hu et al.,2023
香蕉 Musa paradisiaca	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	PDS（0.19 ~ 0.92）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	否 No		Wu et al.,2020
矮牵牛 Petunia hybrida	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	NR（5.3 ~ 17.8）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	否 No		Subburaj et al.,2016
矮牵牛 Petunia hybrida	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	F3H（11.9）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Yu et al.,2020
甘蓝 Brassica oleracea	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	FRI（0.09 ~ 2.25）、 PDS（0.14 ~ 1.33）		CRISPR/Cas9	瞬时表达 Transient expression	否 No		Murovec et al.,2018
	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	GI（17.4）		CRISPR/Cas9	瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Park et al.,2019
	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	PDS1（1.8）		CRISPR/Cas9	瞬时表达 Transient expression	否 No		Lee et al.,2020
	电转染 Electropor- ation	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	PDS1（0 ~ 3.4）		CRISPR/Cas9	瞬时表达 Transient expression	否 No		Lee et al.,2020
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	胚轴 Plumular axis	FAD2（1.89 ~ 12.11）		CRISPR/Cas9	先编辑后清除 Post-editing elimination	是 Yes		Li et al.,2021
大白菜 Brassica rapa subsp. pekinensis	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	FRI（1.15 ~ 12.58）、 PDS（3.78 ~ 24.51）		CRISPR/Cas9	瞬时表达 Transient expression	否 No		Murovec et al.,2018
油菜 Brassica napus	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	FRI、PDS（0）		CRISPR/Cas9	瞬时表达 Transient expression	否 No		Murovec et al.,2018
油菜 Brassica napus	农杆菌 Agrobacterium	DNA	胚轴 Plumular axis	FAD2（12.92 ~ 12.97）		CRISPR/Cas9	先编辑后清除 Post-editing elimination	是 Yes		Li et al.,2021
杨树 Populus	基因枪 Gene gun	DNA	愈伤组织 Callus	CCR2（3）		CRISPR/Cas9	瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Lennart et al.,2023
橡胶树 Hevea brasiliensis	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	FT、 TFL1（3.73 ~ 20.11）		CRISPR/Cas9	瞬时表达 Transient expression	否 No		Fan et al.,2020
辣椒 Capsicum annuum	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	MLO2（0.2 ~ 17.6）		CRISPR/Cas9	瞬时表达 Transient expression	否 No		Kim et al.,2020
	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	MLO2（9.9 ~ 19.3）		CRISPR/Cas12a	瞬时表达 Transient expression	否 No		Kim et al.,2020
	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	PDS（25.2 ~ 78.0）		CRISPR/Cas12a	瞬时表达 Transient expression	否 No		Liu et al.,2023b
甜椒 Capsicum annuum	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	MLO2（0.5 ~ 11.3）		CRISPR/Cas9	瞬时表达 Transient expression	否 No		Kim et al.,2020
甜椒 Capsicum annuum	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	PDS（42.7 ~ 64.0）		CRISPR/Cas12a	瞬时表达 Transient expression	否 No		Liu et al.,2023b
樱桃Cerasus pseudocerasus	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	ER（52.1）		CRISPR/Cas12a	瞬时表达 Transient expression	否 No		Liu et al.,2023b
花生 Arachis hypogaea	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	PDS（59.5 ~ 73.1）、 AHAS1（60.8）		CRISPR/Cas12a	瞬时表达 Transient expression	否 No		Liu et al.,2023b

物种 Species	投送方式 Delivery methods	投送形式 Delivery form	植物受体 Receptor	基因（编辑效率/%） Gene（Editing efficiency）	系统 System		策略 Strategy	再生 Regene-ration		参考文献 Reference
拟南芥 Arabidopsis thaliana	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	AOC（16）， BRI1（54 ~ 71）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	否 No		Woo et al.,2015
拟南芥 Arabidopsis thaliana	农杆菌 Agrobacterium	DNA	未成熟胚 Immature embryo	GL（1.6）	CRISPR/Cas9		先编辑后清除 Post-editing elimination	是 Yes		Kelliher et al.,2019
烟草 Nicotiana tabacum	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	AOC（44）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	否 No		Woo et al.,2015
	农杆菌Agrobacterium	DNA	外植体 Explant	PDS（8.2）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Chen et al.,2018
	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	ACO（0.08 ~ 0.90）	CRISPR/Cas12a		瞬时表达 Transient expression	否 No		Kim et al.,2017
	病毒 Virus	RNA	细胞悬浮液 ECS	PDS（57）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Ma et al.,2020
	脂质体 Liposomes	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	pporRFP（6）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	否 No		Liu et al.,2020
	基因枪 Gene gun	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	pporRFP（3）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	否 No		Liu et al.,2020
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	叶片 Leaf	ALS/PDS（< 35）	CRISPR/Cas12a & CBE		共编辑 Co-editing	是 Yes		Huang et al.,2023
	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	PDS（15.4 ~ 68.6）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Liu et al.,2023b
本氏烟草 Nicotiana benthamiana	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	PDS，RDR6， SGS3（40 ~ 91）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	否 No		Ma et al.,2020
	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	PDS（57）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Ma et al.,2020
	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	TOM1（62）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Ariga et al.,2020
	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	TOM1（61）	CBE		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Ariga et al.,2020
	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	PDS（68.1），FucT（46.4），DCL2（31.3）	CRISPR/Cas12a		瞬时表达 Transient expression	否 No		Liu et al.,2023b
	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	PDS（21.1 ~ 95.0），RDR6 （61.5 ~ 81.8），SGS3（26.4），FucT（27.7 ~ 55.0），BBL（38.6）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Liu et al.,2023b
	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	PDS（57）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Ma et al.,2020
番茄 Solanum lycopersicum	农杆菌 Agrobacterium	DNA	子叶片 Cytoledon	ALS（4.90）	CBE		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Danilo et al.,2019
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	叶片 Leaf	ALS（12.9）	CBE		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Veillet et al.,2019
番茄 Solanum lycopersicum	农杆菌 Agrobacterium	DNA	愈伤组织 Callus	ALS/ER（18.80）	CRISPR/Cas12a & CBE		共编辑 Co-editing	是 Yes	Huang et al.,2023
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	愈伤组织 Callus	ALS/RBL2
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	愈伤组织 Callus	ALS/ RbohD（12）
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	愈伤组织 Callus	ALS/SlEDS1/SlPAD4（36.30）
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	愈伤组织 Callus	ALS/DMR6/SlINVINH1（42.10）
	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	PDS（62.9）	CRISPR/Cas12a		瞬时表达 Transient expression	否 No	Liu et al.,2023b
	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	PDS（21.2 ~ 78.2）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes	Liu et al.,2023b
小麦 Triticum aestivum	基因枪 Gene gun	DNA	胚 Embryo	GASR7、GW2、 LOX2（4.8 ~ 36.8）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes	Zhang et al.,2016
	基因枪 Gene gun	RNA	胚 Embryo	GW2 （35.30）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes	Zhang et al.,2016
	基因枪 Gene gun	RNA	未成熟胚 Immature embryo	GASR7、GW2、LOX2	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes	Liang et al.,2018
	基因枪 Gene gun	核糖核酸蛋白复合物RNP	未成熟胚 Immature embryo	GASR7、GW2、 LOX2（1.8 ~ 33.6）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes	Liang et al.,2018
	基因枪 Gene gun	核糖核酸蛋白复合物RNP	未成熟胚 Immature embryo	GW2（21.8 ~ 33.4）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes	Liang et al.,2017
	基因枪 Gene gun	核糖核酸蛋白复合物RNP	未成熟胚 Immature embryo	GASR7（45.3）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes	Liang et al.,2017
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	未成熟胚 Immature embryo	GT（0.68）	CRISPR/Cas9		先编辑后清除 Post-editing elimination	是 Yes	Kelliher et al.,2019
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	未成熟胚 Immature embryo	BRI1（3.6 ~ 33）BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE1）、SD1（9 ~ 50）	CRISPR/Cas9		先编辑后清除 Post-editing elimination	是 Yes	Budhagatapalli et al.,2020
玉米 Zea mays	基因枪 Gene gun	核糖核酸蛋白复合物RNP	胚 Embryo	LIG1（9.7）ALS、 MS26（2.4）、MS45（4.0）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes	Svitashev et al.,2016
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	未成熟胚 Immature embryo	VLHP（8.8）、GW（4.7）	CRISPR/Cas9		先编辑后清除 Post-editing elimination	是 Yes	Kelliher et al.,2019
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	未成熟胚 Immature embryo	LG1（4.1）	CRISPR/Cas9		先编辑后清除 Post-editing elimination	是 Yes	Wang et al.,2019
	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	IPK（0.85 ~ 5.85）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	否 No	Sant’Ana et al.,2020
水稻 Oryza sativa	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	P450（19）、DWD1（8.4）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	否 No	Woo et al.,2015
水稻 Oryza sativa	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	合子 Zygote	DsRed2（25）、 DL（13.6）、GW7（21.4）、 GCS1（64）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes	Toda et al.,2019
莴苣 Lactuca sativa var. ramosa	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	BIN2 (46)	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Woo et al.,2015
马铃薯 Solanum tuberosum	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	GBSS（1 ~ 25）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Andersson et al.,2018
	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	PPO2（27 ~ 68）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		González et al.,2019
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	块茎、叶片 Tuber，leaf	PDS（47 ~ 88）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Bánfalvi et al.,2020
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	茎、叶柄 Stem，petiole	ALS（10）	CBE		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Veillet et al.,2019
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	叶片 Leaf	ALS/ DMR6（33.3）	CRISPR/Cas12a & CBE		共编辑 Co-editing	是 Yes		Huang et al.,2023
大豆 Glycine max	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	FAD2（0 ~ 11.7）	CRISPR/Cas12a		瞬时编辑 Transient expression	否 No		Kim et al.,2017
大豆 Glycine max	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	子叶、原生质体 Cotyledonprotoplast	FAD2（1.9 ~ 17.5）	CRISPR/Cas12a		瞬时编辑 Transient expression	否 No		Kim & Choi,2020
苹果 Malus pumila	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	DIPM1（6.7）、DIPM2（0.5 ~ 3.3）、DIPM4（2.5 ~ 6.9）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	否 No		Malnoy et al.,2016
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	外植体 Explant	DIPM4（1.55 ~ 2.55）	CRISPR/Cas9		先编辑后清除 Post-editing elimination	是 Yes		Pompili et al.,2020
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	外植体 Explant	DIPM1、DIPM4（0 ~ 100）	CRISPR/Cas9		先编辑后清除 Post-editing elimination	是 Yes		Dalla Costa et al.,2020
葡萄 Vitis vinifera	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	MLO-7（0.10）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Post-editing elimination	否 No		Malnoy et al.,2016
葡萄 Vitis vinifera	农杆菌 Agrobacterium	DNA	愈伤组织 Callus	MLO7和IdnDH（0 ~ 50）	CRISPR/Cas9		先编辑后清除 Post-editing elimination	是 Yes		Dalla Costa et al.,2020
柑橘 Citrus reticulate	农杆菌 Agrobacterium	DNA	上胚轴 Epicotyl	ALS/Lob1启动子（1.90）	CRISPR/Cas12a & CBE		共编辑 Co-editing	是 Yes		Huang et al.,2023
柑橘 Citrus reticulate	农杆菌 Agrobacterium	DNA	上胚轴 Epicotyl	ALS	CBE		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Huang et al.,2022
香蕉 Musa paradisiaca	农杆菌 Agrobacterium	DNA	胚性细胞悬浮系 ECS	PDS（89.29）	CRISPR/Cas9		先编辑后清除 Post-editing elimination	是 Yes		Hu et al.,2023
香蕉 Musa paradisiaca	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	PDS（0.19 ~ 0.92）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	否 No		Wu et al.,2020
矮牵牛 Petunia hybrida	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	NR（5.3 ~ 17.8）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	否 No		Subburaj et al.,2016
矮牵牛 Petunia hybrida	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	F3H（11.9）	CRISPR/Cas9		瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Yu et al.,2020
甘蓝 Brassica oleracea	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	FRI（0.09 ~ 2.25）、 PDS（0.14 ~ 1.33）		CRISPR/Cas9	瞬时表达 Transient expression	否 No		Murovec et al.,2018
	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	GI（17.4）		CRISPR/Cas9	瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Park et al.,2019
	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	PDS1（1.8）		CRISPR/Cas9	瞬时表达 Transient expression	否 No		Lee et al.,2020
	电转染 Electropor- ation	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	PDS1（0 ~ 3.4）		CRISPR/Cas9	瞬时表达 Transient expression	否 No		Lee et al.,2020
	农杆菌 Agrobacterium	DNA	胚轴 Plumular axis	FAD2（1.89 ~ 12.11）		CRISPR/Cas9	先编辑后清除 Post-editing elimination	是 Yes		Li et al.,2021
大白菜 Brassica rapa subsp. pekinensis	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	FRI（1.15 ~ 12.58）、 PDS（3.78 ~ 24.51）		CRISPR/Cas9	瞬时表达 Transient expression	否 No		Murovec et al.,2018
油菜 Brassica napus	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	FRI、PDS（0）		CRISPR/Cas9	瞬时表达 Transient expression	否 No		Murovec et al.,2018
油菜 Brassica napus	农杆菌 Agrobacterium	DNA	胚轴 Plumular axis	FAD2（12.92 ~ 12.97）		CRISPR/Cas9	先编辑后清除 Post-editing elimination	是 Yes		Li et al.,2021
杨树 Populus	基因枪 Gene gun	DNA	愈伤组织 Callus	CCR2（3）		CRISPR/Cas9	瞬时表达 Transient expression	是 Yes		Lennart et al.,2023
橡胶树 Hevea brasiliensis	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	FT、 TFL1（3.73 ~ 20.11）		CRISPR/Cas9	瞬时表达 Transient expression	否 No		Fan et al.,2020
辣椒 Capsicum annuum	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	MLO2（0.2 ~ 17.6）		CRISPR/Cas9	瞬时表达 Transient expression	否 No		Kim et al.,2020
	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	MLO2（9.9 ~ 19.3）		CRISPR/Cas12a	瞬时表达 Transient expression	否 No		Kim et al.,2020
	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	PDS（25.2 ~ 78.0）		CRISPR/Cas12a	瞬时表达 Transient expression	否 No		Liu et al.,2023b
甜椒 Capsicum annuum	聚乙二醇 PEG	核糖核酸蛋白复合物RNP	原生质体 Protoplast	MLO2（0.5 ~ 11.3）		CRISPR/Cas9	瞬时表达 Transient expression	否 No		Kim et al.,2020
甜椒 Capsicum annuum	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	PDS（42.7 ~ 64.0）		CRISPR/Cas12a	瞬时表达 Transient expression	否 No		Liu et al.,2023b
樱桃Cerasus pseudocerasus	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	ER（52.1）		CRISPR/Cas12a	瞬时表达 Transient expression	否 No		Liu et al.,2023b
花生 Arachis hypogaea	病毒 Virus	RNA	叶片 Leaf	PDS（59.5 ~ 73.1）、 AHAS1（60.8）		CRISPR/Cas12a	瞬时表达 Transient expression	否 No		Liu et al.,2023b

载体 Vector	成分 Composition	介导方式 Style	编辑效率 Editing efficiency	脱靶率 Off-target editing efficiency	稳定性 Stability	设计复杂性 Design complexity	外源DNA整合 Exogenous DNA integration
脱氧核糖核酸载体 DNA vector	表达Cas蛋白和向导核糖核酸载体Vector epxressing Cas protein and sgRNA	直接/间接 Direct/indirect	++	+++	+++	+++	有/无 Yes/No
核糖核酸复合物 RNA complex	翻译Cas蛋白的信使核糖核酸，向导核糖核酸 mRNA for translation of Cas proteins，gRNA	直接 Direct	+	++	+	++	无 No
核糖核酸病毒载体 RNA virus vcetor	表达病毒蛋白和基因组编辑元件的载体 Vector expressing viral proteins and genome editing components	间接 Indirect	+++	/	+++	+++	无 No
核糖核酸蛋白复合物RNP	Cas蛋白和向导核糖核酸 Cas proteins and gRNA	间接 Indirect	+++	+	++	+	无 No

载体 Vector	成分 Composition	介导方式 Style	编辑效率 Editing efficiency	脱靶率 Off-target editing efficiency	稳定性 Stability	设计复杂性 Design complexity	外源DNA整合 Exogenous DNA integration
脱氧核糖核酸载体 DNA vector	表达Cas蛋白和向导核糖核酸载体Vector epxressing Cas protein and sgRNA	直接/间接 Direct/indirect	++	+++	+++	+++	有/无 Yes/No
核糖核酸复合物 RNA complex	翻译Cas蛋白的信使核糖核酸，向导核糖核酸 mRNA for translation of Cas proteins，gRNA	直接 Direct	+	++	+	++	无 No
核糖核酸病毒载体 RNA virus vcetor	表达病毒蛋白和基因组编辑元件的载体 Vector expressing viral proteins and genome editing components	间接 Indirect	+++	/	+++	+++	无 No
核糖核酸蛋白复合物RNP	Cas蛋白和向导核糖核酸 Cas proteins and gRNA	间接 Indirect	+++	+	++	+	无 No

植物CRISPR/Cas无外源DNA基因组编辑技术研究进展

Advances in the CRISPR/Cas DNA-Free Genome Editing in Plant

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