马铃薯类病毒cDNA双体探针的研制及其在检测上的应用

园艺学报 ›› 2009, Vol. 36 ›› Issue (10): 1531-1537.

马铃薯类病毒cDNA双体探针的研制及其在检测上的应用

吕典秋*;邱彩玲;王绍鹏;李勇;高云飞

(黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所, 农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心, 哈尔滨150086)

收稿日期:2009-06-12 修回日期:2009-08-19 出版日期:2009-10-25 发布日期:2009-10-25
通讯作者: 吕典秋

Development of cDNA Dimeric Probes and Its Application in Diagnosis ofPotato spindle tuber viroid

LüDian-qiu*; QIU Cai-ling;WANG Shao-peng;LI Yong;GAO Yun-fei

(Viruses-free Seedling Research Institute, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Supervision and Testing Center for Virus-free Potato Seeds of Ministry of Agriculture,Harbin 150086, China)

Received:2009-06-12 Revised:2009-08-19 Online:2009-10-25 Published:2009-10-25
Contact: LüDian-qiu

摘要/Abstract

摘要： 在马铃薯纺锤块茎类病毒( Potato spindle tuber viroid, PSTVd) 基因组中BamHⅠ位点处(87～92 nt) , 设计两对含有BamHⅠ重叠区(overlop) 的引物。将PCR扩增获得的全PSTVd分别插入到pGM2T载体中。通过BamHⅠ位点, 将两个PSTVd单体连接, 构建PSTVd双体体。以此载体为模板,通过PCR标记技术, 制备了高灵敏高专化的PSTVd双cDNA地高辛标记探针。以CDP-Star为反应底物进行化学发光反应结果判读, 建立了PSTVd的高效杂交检测体系。该体系可以对马铃薯薯块、叶片、芽等不同组织样品进行检测, 检测灵敏度达到0.05 pg。通过对67份田间采集的样品和实验室保存的资源材料进行检测, 比较了cDNA双体探针核酸斑点杂交技术( nucleic acid spot hybridization, NASH) 、反转录聚合酶链式反应( reverse-transcriptional polymerase chainreaction, RT-PCR) 和往返—聚丙烯酰胺凝胶电泳( return-polyacrylamide gel electrophoresis, R-PAGE) 检测技术的阳性样品检出率, 结果显示, NASH技术阳性样品检出率为67.7% , 与RT2PCR相一致, 高于R2PAGE技术的阳性检测率(53.7% ) 。

关键词: 马铃薯, 马铃薯纺锤块茎类病毒, 探针, 双体, 核酸斑点杂交

Abstract: Two PCR amplifying full-length PSTVd (Potato spindle tuber viroid) with the B amHⅠ (87-92 nt) overlop were linked to pGM-T to construct the recombinant vector containing dimeric PSTVd cDNA. Highly sensitive and specific dimeric probe labeled with digoxin was produced with PCR amplification. An efficient hybridization system was established bywith the substrate of CDP-star in this study. The minimum concentration of PSTVd detected by this probe was 0.05 pg. The samples prepared from leaves, tubers and sprouts could be detected successfully. Compared the positive sample percentage detected from potato fields and conserved potato resource of plantlets in vitro with RT-PCR ( reverse-transcrip tional polymerase chain reaction) and R-PAGE ( return-polyacrylamide gel electrophoresis) , NASH ( nucleic acid spot hybridization)
could give the same positive sample percentage as RT-PCR did ( 67.7% ) , but was higher than R-PAGE (53.7% ).

Key words: potato, Potato spindle tuber viroid, PSTVd, probe, dimeric PSTVd, nucleic acid spot hybridization (NASH)

中图分类号:

S 532

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